XV. MÄ°LLÄ° TÃœRK ORTOPEDÄ° VE TRAVMATOLOJÄ° KONGRE KÄ°TABI

ABSTRAKTLAR, BÖLÜM 14: ARAÅžTIRMALAR

<< | Ýçindekiler | >>

MONOLAYER SİSTEMDE KONDROSİT KÜLTÜRÜ ÜRETİMİ

Eklem kıkırdağı yüksek oranda differansiye olmuş, vasküler kan desteği eksik ve yalnızca sınırlı rejenarasyon kabileyetine sahip özelleşmiş destekleyici bir konnektif dokudur. Snovyal ve diarthodial eklemlerde yüzeylerin eklemleşmesini sağlar, menisküsler, tendonlar ve ligamentlerle beraber kemikler arasındaki yük iletimini ve dağıtımını sağlar. Bundan dolayı kartilaj doku zedelenmelerinde geliştirilmiş ve tedavi yöntemlerine ihtiyaç duyulmaktadır(1,2,4).

1973 yılında Hunter'ın "Hipokrat'tan günümüze ülsere olmuş kartilaj zor bir durumdur ve bir kere hasar oluşumu tedavi edilemez." şeklinde ifade ettiği gibi eklem kıkırdağı defektleri hala pratikte sorun oluşturur ve özellikle genç hastalarda ağrı ve eklem disfonksiyonuyla beraber görülür. Dizdeki eklem kartilajının full-thickness defektleri osteoartrit gelişimine doğru ilerleyebilir(1,3,4).

Son on yılda kartilaj rejenerasyonunu artırmak için değişik girişimlerde bulunulmuştur. Bunlar arasında izole edilmiş kondrositler değişik biodegredable matriksler içine gömülerek doku onarım prosesi indüklenmesi ile ilgili çalışmalar yoğunluk kazanmıştır(1,2,4).

Bu çalışmada, kartilaj doku mühendisliğinin ilk aşaması olan kondrositlerin izolasyonu ve sayısının arttırılarak biodegredable biokompatible biomaterylallerde kullanılacak uygun kondrositlerin elde edilmesi ve fenotipik özelliklerinin araştırılması amaçlanmıştır.

Materyal ve Metod

Cerrahi işlem sırasında, steril koşullar altında, hastalardan normal eklem kıkırdak dokusu alındı. Hastaların yaşı 49 ile 68 arasında değişmekteydi. Alınan materyal derhal taşıma solusyonuna konuldu. Taşıma solüsyonu olarak l0cc RPMI 1640 veya DMEM (Sigma) kullanıldı. Alınan örnekler işleme başlanılana kadar %5 C02'li kuluçka dolabında saklandı. Sonra alınan materyaller laminer hava akımlı kabin içinde taşıma solüsyonundan alınarak petri kabına konuldu ve 15 numaralı bistürü ile 0.5mm'den ufak olâcak şekilde parçalara ayrıldı. Sonra üzerine 1 mg/ml tip II kollajenaz (Seromed) ve 0.1 mg/ml hyalurinidaz (Seromed) konsantrasyonda olacak şekilde enzimatik soİüsyonlar eklenerek 37°C'de manyetik karıştırıcı içerisinde 12 saat süreyle inkübe edildiler (Şekil 1 ). Elde edilen hücre süspansiyonu 70 mm por çaplı naylon filitreden (Falcon) geçirildi. Bu süspansiyona %90 DMEM ve %10 Fetal calf serumu içeren solüsyondan 40 ml eklenerek 1000 devirde 10 dakika santrifüje (Heraus) edildi. Tüpün dibinde oluşan pelletin kahverengi olan rengi kullanılan kollajenazdan dolayıdır. Sıvı kısım pipetle alınarak üzerine 2ml DMEM solüsyonu eklendi ve cam pipetle homojenize edildi. Sonra bu solusyondan 20 I'lik örnek alınarak Trypan mavisi ile viabelite testi yapıldı ve sayma camına alınan hücrelerin sayısı 2 milyondan az ise içinde l0cc komplet medium (100cc DMEM, 20cc Fetal calf serum, 1000 IU/ml Penisilin, 0.1 mg/ml Streptomisin) içeren 25cm2'lik doku kültürü flasklarına (Falcon) konuldu. 24 saat sonra flask, invert ışık mikroskobunda incelendiğinde flaskın zeminine kondrositlerin yapıştığı izlendi. Ölü hücreler ise mediumun içinde yüzmekteydi. Üç günde bir flask içindeki mediumun 3/4'lük kısmı değiştirilerek kondrositler beslendi. İlk hücre sayısına bağlı olarak 4-7. günlerde tüm flask zeminin kondrositlerle kaplanıldığı izlendi. Bu flasklara 3 ml Trypsin/EDTA (Sigma) solüsyonundan eklenilerek hücreler 75 cm2'lik flasklara aktarıldı. 15-20. gün içinde kondrositlerin bu flaskıda dolduruduğu izlendi (Şekil 2 ). Hücreler invert ışık mikroskobunda izlendi.

İmmünohistokimyasal yöntemle kollajen tip belirlendi.

Tartışma

Yukarıdaki metodla anlatılan temel ilkeler çerçevesinde, bir grup kıkırdak doku örneklerinin hücre ayrıştırma işleminde manyetik karıştırıcı kullanmadan sadece enzimatik ayrıştırma ile yaklaşık 16 saat içinde hücrelerin sağlıklı bir şekilde ayrıştığını saptadık. Ayrıca literatürlerde enzimatik digesyon işleminde kollajenaz, hyalurinidaz ve deoksiribunükleaz kullanılmaktadır(1,2,4). Bizim bir seri örneğimizde sacedce kollajenaz kullanarak da hücrelerin ayrıştırılabilip, üretilebileceğini saptadık. Monolayer sistemde hücrelerin üretiminin getirdiği bazı dezavantajlar vardır. Tersiyer kültüründeki kondrositler fibroblast benzeri değişiklikler göstermekte ve tip 1 kollajen üretmektedir. Bundan dolayı bu aşamadan sonra üç boyutlu hücre taşıyıcı sistemlerine ihtiyaç duyulmaktadır(2).

Sonuç

Bu çalışmamızda, otolog kondrositler izole edilmiş ve invitro koşullarda monolayer sistemde hücre sayısı arttırılmıştır. Üç boyutlu hücre taşıyıcılarının gelişmesiyle, organotipik hücre kültürü kullanarak insan kartilaj dokusu sentezlenecek ve şekil ve fonksiyonu restore etmek için resipient alana implante edilecektir.

Not: Bu çalışma Prof. Dr. Ethem Gür, Doç Dr. Mustafa Başbozkurt ve Doç. D. Gönül Uğur tarafından yönetilmektedir.

Referanslar

1. Brittberg, M., Lindahl, A.0 Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte tamsplantation. The New England Journal of Medicine, 1994, 331:889-895.

2. Bujia, J., P. Pitzke E. Wilmes: Culture and cryopreservatin of chondrocystes from human cartlage: relevance for cartilage allografting in otolaryngology. ORL., 1992, 54:80-84.

3. Green, W. G.: Articular cartilage repair. Behaviour of rabbit chondrocytes during tissue culture and subsequent allografting. Clin. Orthop., 1977, 124:237-250.

4. Noguchi, T., Oka, M.: Repair of osteochondral defects with grafts of cultured chondrocystes: Comparison of allografts and isografts. Clin. Orthop. & Related Research, 1994, 302:251-258.