XV. MÄ°LLÄ° TÃœRK ORTOPEDÄ° VE TRAVMATOLOJÄ° KONGRE KÄ°TABI

ABSTRAKTLAR, BÖLÜM 14: ARAÅžTIRMALAR

<< | Ýçindekiler | >>

SIÇANLARDA MENİSKÜS DOKUSUNA IN VİVO GEN TRANSFERİ (HVJ-LİPOSOM YÖNTEMİ KULLANILARAK YAPILAN BİR DENEYSEL ÇALIŞMA)

Menisküs dokusun tümüyle çıkarıldığı olguların uzun izlenmeleri sonunda diz ekleminde dejeneratif değişikliklerin meydana geldiği yapılan çalışmalarda ortaya konulmuştur(1,2). Menisküs dokusunun korunmasını önemi anlaşıldıktan sonra uygun olgularda menisküs dokusunun onarımı ve menisküs.transplantasyonu yeni tedavi seçenekleri olarak karşımıza çıkmıştır(3). Bu yeni cerrahi yaklaşımların yanında yumuşak doku iyileşmesini hücresel düzeyde etkileyebilecek faktörler de araştırılmış, büyüme faktörlenini (growth faktörler) yumuşak doku iyileşmesine olan olumlu katkıları bildirilmiştir (4,5). Cerrahi yöntemlerin menisküs dokusu onarımında %100 başarılı olmadığı düşünüldüğünde bu yöntemlerin iyileşmeyi hücresel düzeyde etkileyecek faktörler ile birlikte kullanılması bize önemli avantajlar sunabilir.

Growth faktörlerin ve sitokinlerin dokularda etkin dağıtımını sağlayacak bir sistem bugüne kadar ortaya konulamamıştır. Bu aşamada iyileşmekte olan dokuya yapılacak gen transferi, iyileşmekte otan dokuyu etkilemek açısından önemli görülmektedir. Transfer edilen genin ürünü hedef hücrede, gen fonksiyon gördüğü sürece birikecek ve iyileşme dokusuna katkıda bulunacaktır.

Bu çalışmada iyileşmekte olan menisküs dokusuna gen transferinin olumlu etkisi olabileceği düşüncesi ile, menisküs dokusuna in vivo gen transferinin mümkün olup olmadığı sıçanlarda HVJ (Hemagglutinating virus of Japan)-liposom kompleksleri kullanılarak araştırılmıştır.

Gereç ve Yöntem

Plasmid ve HVJ-liposom komplekslerinin hazırlanması: Tavuk aktin öncülünden elde edilen escherichia coli [igalaktozidaz (-gal) cDNA ve HVJliposomları daha önce belirtildiği şekilde hazırlandı(6,7). Özetle, 10 mg kuru lipid karışım (fosfatidilkolin, fosfatidilserin ve kolestrerol) ve plasmid DNA, yüksek mobiliteli grup-1 (HMG-1) protein ile inkübe edilerek ünilameller liposomlar hazırlandı. Daha sonra bu liposomlar ve ultraviole ışını ile inaktive edilen HVJ karıştırılarak, HVJ-liposom kompleksleri oluşturuldu. Bu şekilde dış yüzünde inaktive HVJ bulunan liposomlar içerisinde plasmid DNA ve HMG-1 hazırlanmış oldu.

Cerrahi model ve HVJ-liposom Kompleksinin enjeksiyonu: Otuz adet 12 haftalık erkek Wistar sıçanın sağ dizlerinde, mekroskop altında medial menisküs medialinde bistüri kullanılarak tam radial yırtık oluşturuldu. Cerrahi işlem sırasında sıçanlara intraperitonial olarak pentobarbital (50 mg/kg) verilerek anestezi yapıldı. Sıçanlar 15'er sıçandan oluşan 2 gruba bölündü. Birinci grupta bulunan 15 sıçandan 10 tanesine, hazırlanan HVJliposom DNA kompleksleri eklem içine (intra-artiküler) verildi. Bu grupta yer alan 5 sıçana da DNA içermeyen HVJ-liposom kompleksleri aynı yöntemle enjekte edildi ve bu sıçanlar kontrol grubu olarak kullanıldı. İkinci grupta yer 15 sıçandan 10'una hızırlanan HVJ-liposom DNA kompleksleri femoral arter içerisine, mikroskop altında enjekte edilerek verildi. Kontrol grubu olarak kullanılan geriye kalan 5 sıçana da DNA içermeyen solüsyon enjekte edildi. İntra-arterial enjeksiyonlar sonrasında femoral arter ve ven klemplenerek solüsyon alt ekstremitede 5 dakika süre ile göllendirildi. Enjeksiyonlardan sonraki 3,7,14,28 ve 56. günlerde her iki grupta deney gruplarında 2'şer ve kontrol gruplarından 1'er sıçan öldürüldü.

(-gal sentezini tespiti: Sıçanlar öldürüldükten sonra medial menisküsleri tümü ile eksize edilerek %4 parafomzaldehid içeren fosfat tampon solüsyonu ile tespit edildi (pH 7.4). Tespit sonrasına 6 mm kalınlıkta dondurulmuş kesitler hazırlandı, bu kesitler 5-bromo-4kloro-3-indolil (3-D-galaktozidaz (X-gal) ile boyandı.

Gen transferi etkinliğinin tespft edilmesi: Etkinliğin tespit edilebilmesi için X-gal ile boyanan kesitler, hücrelerin sayılabilmesi amacı ile bir kez de hematoksilen çekirdek boyası ile boyandı. Gen tranferinin etkinliği, ışık mikroskobunda rasgele sayılan 1000 hücre içerisinde (10 değişik alanda) [3-gal sentezleyen, mavi-yeşil boyanan X-gal pozitif hücrelerin oranı tespit edilerek değerlendirildi.

Bu çalışmanın protokolü Osaka Üniversitesi Hayvan Deneyleri Komitesi'nce onaylandı.

Sonuçlar

Gen transferinin etkinliği eklem için enjeksiyon yapılan deney grubunda, 3'üncü günde %2.8,7'nci günde %4.7, 14'üncü günde %5.1, 28'inci günde %0.7 ve 56'ıncı günde %0.3 olarak tespit edildi. Arter içine enjeksiyon yapılan deney grubunda etkinlik 3'üncü günde %2.4, 7'inci günde %4.8, 14'üncü günde %4.9, 28'inci günde %0.9 ve 56'ncı günde %0.3 olarak bulundu. Her iki kontrol grubunda, tüm kontrol kesitlerinde sadece birkaç hücre X-gal ve mavi-yeşil olarak boyanmıştı.

Her iki deney grubunda pozitif olarak mavi-yeşil boyanan hücrelerin büyük çoğunluğunun yara yerinde olduğu yara alanı dışındaki menisküs dokusunda pozitif boyanan hücrelerin çok az sayıda olduğu tespit edildi.

İntra-artiküler enjeksiyon yapılan deney grubunda pozitif boyalı hücrelerin yaranın ekleme bakan yüzünde diğer gruba oranla daha fazla olduğu gözlendi. Arter içine enjeksiyon yapılan deney grubunda yaradaki damar çevrelerinde ve menisküs-kapsül birleşme yerindeki damar çevrelerinde pozitif boyalı hücrelerin varlığı intra-artiküler enjeksiyon yapılan gruba oranla daha yüksek oranda tespit edildi.

Tartışma

Gen transferi önümüzdeki yüzyılda tıbbın pek çok dalında bize önemli tedavi seçenekleri sunacak bir yöntemdi. Bu çalışmada menisküs dokusuna gen transferi in vivo olarak literatürde ilk kez gerçekleştirilmiştir. İyileşmekte olan dokulara gen transferi ile bu dokularda bazı biyolojik değişiklikler olduğu gösterilmiştir (8). İyileşmekte olan menisküs dokusuna gen transferi istediğimiz ürünlerin, örneğin büyüme faktörlerinin iyileşmekte olan dokuda belli bir süre salınımını sağlayacak bu şekilde iyileşme dokusunun kalitesini ve hızını etkilemek mümkün olabilecektir.

Çalışmamızda gen transferi etkinliğinin 7 ve 14'üncü günlerde yüksek olduğu 28 ve 56'ncı günlerde etkinliğin azalmakta birlikte hala bazı hücrelerde etkinliğini sürdüğü gösterilmiştir. Bu bulgular iyileşmekte olan menisküs dokusunda gen transferi etkinliğinin geçici olduğunu gösterir. İyileşme sürecinin belirli bir süre için devam ettiği düşünüldüğünde geçici gen tranferi bu gibi durumlarda avantaj olarak sayılabilir. Ayrıca gen transfesi yapılabilen hücrelerin çoğunun yara dokusunda olması, tedavi sırasındaki asıl amacımız yara dokusunu etkilemek olduğu düşünüldüğünde ikinci bir avantaj olarak karşımıza çıkar.

İntra-artiküler ve intra-arterial yolla gen transferi etkinlik yüzdeleri arasında fark tespit edilmemiştir. Intra-artiküler enjeksiyonun arter içine yapılmasına göre komplikasyon riskinin daha düşük olması, intra-artiküler enjeksiyonun birçok defa kolaylıkla yapılabilmesi menisküs dokusu ve diğer diz içi dokulara gen tranferinde eklem içine enjeksiyonu avantajlı kılar. Ayrıca intra-artiküler enjeksiyonda solüsyonun sınırlı bir boşluğa yapılması, olabilecek sistemik etkilerin önlenmesi açısından da önemlidir.

Gen transferi etkinliği düşük olmakla birlikte, bu yöntem diz ekleminde yapılacak menisküs ya da diğer diz içi dokularla ilgili gen transferi çalışmaları için iyi bir deneysel model oluşturmaktadır.

Referanslar

1. Allen PR, Denham RA, Swan AV. Late degenerative changes after meniscectomy: factors affecting teh knee affer operation. J Bone Joint Surg. 1984, 668: 666-71.

2. Jorgensen U, Sonne-Holm S, Lauridsen F, et al. Long term follow-up of meniscectomy in athletes: A prospective longitudinal study. J Bone Joint Surg. 1987, 698: 80-3.

3. Arnoczk SP. Meniscal transplantation-where do we stand. In Knee Surgery Current Practice. Eds, Aichroth PM, Cannon WD, Patel DV. 1992, 1st ed. Raven Press, New York, p94.

4. Pierce GF, Tarpley JE, Yanagihara D, et. al. Platelet-derived growth factor, tranforming growth factor (31, and basic fibroblast growth factor in dermal wound healing. Am J Pathol. 1992, 140: 1375-88.

5. Schultz G, Rotatori DS, Clark W. EGF and TGF-a in wonud healing and repair. J Cell Biochem. 1991, 45: 346-52.

6. Nakamura N, Horibe S, Matsumoto N, et al. Transient introduction of a foreign gene into healing rat patellar ligament. J Clin Invest. 1996, 97: 226-31.

7. Kaneda Y. Virus (Sendai virfus envelopes)mediated gene transfer. In Cell Biology. A Laboratory Handbook. Ed. Cellis ED. 1994, Academic Press Inc. pp50-7.

8. Nakamura N, Horibe S, Natsuume T, et al. Eariy effect of in vivo introduction of platelet-derived growth factor (PDGF) gene into healing rat patellar ligament. Transactions of the 42 nd Annual Meeting Orthopaedic Research Society. Vol. 21. 1996, 193.